Synthèse et évaluation biologique des JAHA: Inhibiteurs de l’Histone Deacetylase à base de Ferrocene

l’acétylation et la désacétylation sont fondamentales pour le remodelage de la chromatine et la régulation de la transcription génique.1,1b Les histones acétyltransférases favorisent la N-acétylation des queues de lysine sur les protéines histones, alors que les histones désacétylases (HDAC) catalysent l’élimination de l’acétyle. des groupes, conduisant à une répression transcriptionnelle via une chromatine condensée où l’ADN est étroitement enroulé autour du noyau d’histone chargé positivement. La conséquence de ce dernier est le silençage transcriptionnel qui, dans le cancer, contribue à l’évasion de l’apoptose et à la progression du cancer. Les HDACis (inhibiteurs d’HDAC) sont des agents anticancéreux attractifs, car la restauration d’une structure de chromatine hyperacétylée et relaxée conduit à la transcription génique et à la régulation positive d’un certain nombre de protéines proapoptotiques et d’arrêt de croissance (p21 / cip1). La modulation de l’acétylation de protéines non histones peut également contribuer à des effets anticancéreux (par exemple, p53, hsp90). Vorinostat 1 (SAHA, acide suberoylanilide hydroxamique) est l’archétype HDACi.2 & 2e; il a été approuvé pour une utilisation clinique contre le lymphome T cutané (CTCL) et montré pour agir en synergie avec de nombreux agents anticancéreux, y compris les inhibiteurs de kinase et inhibiteurs du protéasome comme ainsi que la radiothérapie.3 − 3cUn nombre de publications récentes ont exploré des manipulations subtiles de ce qu’on appelle “ cap-tail-linker ” pharmacophore de SAHA pour sonder la structure et les modes de liaison (figure ​ L’activité inhibitrice des HDAC est améliorée par la présence de groupes donneurs d’électrons sur la coiffe aryl, comme dans l’analogue diméthylique 2, à l’exception des substituants ortho, qui entraînent une diminution de l’activité due aux collisions stériques lors de la liaison à l’enzyme4. ont examiné les effets des substituants sur les propriétés physiochimiques et les sélectivités de HDACis comme dans les analogues ramifiés 3a et 3b.5,6 Les substituants alkylés adjacents à l’acide hydroxamique conduisent à une perte d’action inhibitrice des HDAC comme dans 3c, attribuée à la perturbation conformationnelle de la liaison de l’acide hydroxamique au zinc dans le site actif de l’enzyme.7,7bFigure 1SAHA et analogues.Nous décrivons ici nos conclusions préliminaires sur la conception d’un analogue SAHA à base de métal pour sonder l’effet d’un phényl bioisostère non planaire, à savoir, une unité de ferrocène , sur l’action inhibitrice des HDAC. Une étude récente a montré que les hybrides SAHA-cis-platine présentaient une faible activité micromolaire contre les HDAC et les lignées cellulaires cancéreuses8. Des études antérieures ont montré que les analogues du ferrocène peuvent présenter une activité anticancéreuse impressionnante et agir comme métalloprotéines efficaces et sondes bioinorganiques moteur. La réaction induite par micro-ondes de la ferrocénylamine 4 avec le méthyl-8-chloro-8-oxooctanoate 5 a donné l’ester méthylique 6 (Schéma 1). Des rendements élevés ont été observés en employant de la triéthylamine comme base par opposition à une base supportée par du polystyrène.De plus, la première procédure évitait la nécessité d’une étape de purification chromatographique. Ensuite, une réaction de 6 avec de l’hydroxylamine, générée in situ à partir de son sel de HCl, a donné le composé désiré, Jay Amin hydroxamic acid (JAHA) 7, dans un rapport global de ca. 50% de rendement. En utilisant des procédures de synthèse connexes, une petite bibliothèque d’analogues de JAHA a été synthétisée pour l’investigation SAR. Par conséquent, le ferrocène homologué 8 (homo-JAHA) a été fait pour sonder l’effet de l’introduction d’un espaceur méthylène dans 7. Un certain nombre d’analogues de JAHA aryl-linker ont ensuite été synthétisés à savoir. les ortho et para-ferrocényl-substitués 9, respectivement, pour évaluer l’effet du groupe organométallique lié à une molécule mère SAHA.Schéma 1Les structures des intermédiaires méthylester à 7, 8 et 9, à savoir, 6, 12 et 13 ont été étudiés à l’état solide par cristallographie aux rayons X pour vérifier la présence du groupe ferrocène et pour aider nos études de modélisation sur 7 (figure S2 et tableau S1 dans l’information de support). L’incorporation de parties organométalliques en ligands protéiques apporte l’avantage potentiel de remplir l’espace d’une manière qui n’est pas possible avec de simples groupes aromatiques planaires ou des systèmes cycliques alicycliques, qui peuvent améliorer l’affinité.11,11b En outre, les ligands contenant des groupes organométalliques peuvent permettre la détermination de la structure radiographique de complexes de ligands de protéines et en facilitant le phasage. Pour explorer le mode de liaison de 7 dans les désacétylases, nous avons effectué des études d’amarrage, en utilisant comme point de départ la structure d’un complexe HDAC8-SAHA.12 Nous avons trouvé que 7 est capable de se lier à SAHA en exploitant les interactions archétypes l’hydroxamate et le zinc catalytique, avec une liaison hydrogène entre le fragment amide du ligand et Asp101. Le groupe ferrocényle de 7 est confortablement logé dans la poche peu profonde formée par Tyr100, Phe152 et Tyr306; cette région de l’enzyme serait malléable et capable de s’adapter aux structures de différents ligands. Ce mode de liaison a suggéré que 7 et SAHA devraient afficher des puissances similaires à HDACis (figure ​ (figure 22) .Figure 2Docked 7, 9 et comparaison à SAHA.) (A) Docked 7 dans le site actif de HDAC8. de 7 à SAHA co-cristallisé (code PDB: 1t69). (c et d) Docké 9 en HDAC8 (superposé sur SAHA dans le panel c) L’ion zinc est représenté en cyan Les … Composé 9, avec le groupe ferrocène substitué à l’ortho-position sur le groupe phényle de SAHA, est amarré de manière similaire (figure ​ (figure 2c) .2c) .Le cycle phényle est tordu par rapport à SAHA co-cristallisé.Avec l’insertion du groupe phényle, par rapport au composé 7, le groupe ferrocène du composé 9 est poussé plus bas dans la sous-poche de l’enzyme, conduisant à un meilleur ajustement dans la rainure hydrophobe formée par Phe 152 et Tyr306 ainsi que par Lys33 et Met274 (figure 2d). Les interactions étroites de van der Waals entre le groupe ferrocène et les résidus dans la sous-poche pourraient augmenter sensiblement l’affinité du composé 9. Le composé 7 a été testé pour l’action inhibitrice contre les HDAC de classe I, IIa et IIb (1 − 9) et comparé avec le SAHA 1. Les deux ont des profils inhibiteurs HDAC similaires, présentant une CI50 similaire valeurs, y compris pour HDAC8, qui consolide gravement nos études de modélisation (Tableau 1). Le composé 8 a un profil similaire à celui de 7 pour les HDAC 1 − 3, bien qu’il soit ca. 10 fois moins puissant vers HDAC6 et quatre fois plus puissant vers HDAC8. Le composé 10 surpasse considérablement les autres ferrocènes ainsi que SAHA vis-à-vis des HDAC 1, 2 et notamment contre la classe IIb HDAC6 (IC50 = 90 pm), tandis que 9 montre la valeur IC50 la plus faible vers HDAC8 avec IC50 = 2 nM. Le composé 11, un analogue de longueur plus courte de 10, présentait une mauvaise inhibition de HDAC, étayant l’importance de la longueur de chaîne sur l’inhibition de HDAC. Aucun des composés 7 a montré une inhibition significative des HDAC de classe IIa (4, 5, 7 et 9), 13 et les données ne sont pas montrées. Tableau 1IC50 Valeurs pour HDACis par rapport à SAHA (1) aCritical au développement de Les sondes chimiques ciblant les HDAC sont la démonstration de l’activité dans un environnement cellulaire. Les composés ont été testés pour la cytotoxicité contre une lignée cellulaire de cancer du sein, et les résultats sont donnés dans le tableau 2.14 SAHA 1 est la plus cytotoxique de la série avec tous les ferrocènes présentant des activités micromolaires à un chiffre. Les analogues 9 et 10 sont moins cytotoxiques que 1, ce qui peut refléter une pénétration cellulaire réduite due à la présence du groupe ferrocène.Tableau 2Cytotoxicité des JAHA et SAHA dans les lignées cellulaires du cancer du sein MCF7Additionnellement, les expériences de coloration au iodure de propidium ont montré que 7 et 10 l’arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire dans les cellules MCF7 (figure S1 dans l’information de support). En accord avec les effets d’autres HDAC, les composés ont diminué la proportion de cellules dans les phases G1 et S du cycle cellulaire, associées à une accumulation de cellules dans G2M.Les composés ont également augmenté la proportion de cellules ayant une teneur en ADN sous-G1, un marqueur de mort cellulaire. Pour évaluer l’activité des composés de plomb issus de cette recherche, nous avons cultivé des cellules érythroleucémiques K562 avec les composés 9 et 10 et quantifié changements dans l’acétylation de la chromatine en vrac (le substrat endogène des déacétylases de classe I) et acétylation de la ß-tubuline (un substrat de HDAC6). Comme le montre la Figure 3, les cellules traitées avec 9 et 10 (10 μ M) ont produit une acétylation comparable de l’histone et de la tubuline comme HDACi 1 approuvé par la FDA (Figure 33). 3Les données basées sur les cellules de cytométrie de flux comparatives pour les analogues 9, 10 et SAHA.JAHA ont été synthétisées avec de bons rendements en utilisant une réaction accélérée cruciale de couplage d’amide médiée par micro-ondes avant la fixation du fragment liant l’acide hydroxamique zinc. montrent une excellente inhibition de HDAC de classe I bien que, pour HDAC8, les valeurs de CI50 sont principalement dans la gamme micromolaire, à l’exception de 9 (CI50 = 2 nM). On a également observé une inhibition nanomolaire ou subnanomolaire de HDAC6 de classe IIb. la manipulation tridimensionnelle de l’aryl “ cap ” SAHA 1 est une stratégie viable pour la synthèse de HDACis Parce que l’inhibition HDAC est souvent améliorée, ces résultats suggèrent que l’utilisation de groupes de plafonnement non planaires peut avoir un potentiel plus large en HDACi conception. Les études actuelles visent à synthétiser les analogues de la JAHA en modifiant le capuchon (métal / coligands), le groupe de liaison et les groupes de liaison pour les études SAR et en utilisant ces analogues comme sondes structurales. D’autres études ont confirmé la perméabilité cellulaire des composés 9 et 10 et identifient la puissance attractive contre les HDAC de classe I et de classe II dans un contexte cellulaire.15 Les composés 9 et 10 sont prometteurs comme sondes bioinorganiques pour les HDAC, et nous étudions activement leur potentiel pour l’obtention de structures cocristallines dans les HDAC ainsi que des études in vivo incluant Xenopus.16,17 | Découverte de PF-04620110, un inhibiteur puissant, sélectif et oral de DGAT-1