Synthèse d’un nouveau suppresseur de β Apoptose -Cell par synthèse orientée vers la diversité

Le diabète de type 1 est causé par la destruction auto-immune de l’insuline # β -cells dans le pancréas. L’infiltration des îlots pancréatiques par les macrophages et la sécrétion de cytokines inflammatoires telles que IL-1 &#x003b2 ;, IFN – γ et TNF – α On pense que l’activation de facteurs de transcription tels que NFkB et STAT1 par ces cytokines déclenche la voie apoptotique intrinsèque dans les modèles de cellules de rongeurs et de cellules humaines.2 Une sonde de petite molécule capable de prévenir ou d’inverser la cytokine la mort cellulaire pourrait avoir un grand potentiel dans le développement de thérapies pour le diabète de type 1 précoce. Des efforts précédents pour supprimer l’apoptose cellulaire avec de petites molécules impliquaient des composés ayant une activité antioxydante ou anti-inflammatoire3,4 et, plus récemment avec des inhibiteurs de l’activité de l’histone désacétylase.5,6 Précédemment, nous avons décrit une série de dosages cellulaires qui peuvent être utilisés pour identifier les suppresseurs de petites molécules de mort cellulaire et examiné les effets des inhibiteurs de la glycogène synthase kinase 3 β .7 Cet écran pilote a identifié de petites molécules qui ont augmenté les niveaux d’ATP, mais la majorité de ces composés n’ont pas eu d’effets sur d’autres aspects de la biologie des cellules, comme dans sécrétion de suline. Par conséquent, nous avons cherché à identifier des suppresseurs plus complets de β -cellule apoptose qui a permis une fonction de β -cell normale. Synthèse orientée vers la diversité (DOS) 8 − 10 a émergé comme une stratégie pratique pour assembler composé bibliothèques avec un haut degré de diversité stéréochimique et squelettique, servant à augmenter les collections de criblage traditionnelles de composés disponibles dans le commerce et de produits naturels.9,11 − 17 composés DOS rivalisent avec les produits naturels en termes de complexité (mesurée par le contenu sp3 et la présence des centres stéréogéniques) 18 − 20 sont conçus pour être facilement modifiés afin de faciliter l’optimisation chimique en aval. Ces principes ont été récemment mis en évidence par un &#x0201c basé sur aldol; construire / couple / paire ” (B / C / P), résultant en une collection de divers anneaux de taille moyenne et grande dérivés d’un intermédiaire linéaire commun.21,22 Nous avons cherché à capitaliser sur cet intermédiaire polyvalent pour augmenter davantage la diversité de notre collection de composés. S’appuyant sur notre succès passé avec la réaction SNAr pour la cycloéthérification22, nous avons cherché à construire une bibliothèque qui fournirait à la fois des relations d’activité et de structure stéréochimique et des relations d’activité (SSAR) dans les écrans primaires pour l’activité biologique. Couplage de cette information avec la capacité de synthétiser rapidement des analogues, en exploitant des voies synthétiques courtes et modulaires, fournit un processus rapide et efficace pour optimiser les hits identifiés dans le criblage à haut débit (HTS). Ici, nous décrivons le développement d’une bibliothèque stéréochimiquement diversifiée d’anneaux de taille moyenne et les résultats d’une campagne de criblage pour la suppression de l’apoptose cellulaire. Une optimisation supplémentaire de la grappe initiale et des études biologiques de suivi ont abouti à un composé capable de restaurer les propriétés physiologiques des cellules en présence de cytokines pro-inflammatoires. La synthèse des échafaudages de la bibliothèque a commencé avec l’intermédiaire linéaire 1, auquel on a accédé en couplant un & amino-acide aminé protégé de manière appropriée avec un amino-alcool, puis en réduisant l’amide résultant.22 Tous les stéréoisomères de l’acide aminé γ et de l’amino-alcool ont été couplés ensemble, résultant dans la génération de 1a & dn-1a – d, permettant de synthétiser la matrice stéréochimique complète des échafaudages. L’acylation de la et du chlorure d’acide 2-fluoro-3-nitrobenzoïque (2) s’est déroulée doucement pour donner le précurseur à l’étape clé, une réaction intramoléculaire de SNAr (Schéma 1). Alors que nous avions prévu que la stéréochimie pourrait jouer un rôle dans l’efficacité de la formation du cycle22, tous les stéréoisomères ont réagi doucement avec le fluorure de césium pour la désilylation suivie d’une cyclisation pour donner le 3a désiré avec un excellent rendement. La manipulation des groupes fonctionnels pour préparer la production en bibliothèque en phase solide a été réalisée par un processus par étapes impliquant: (1) la réduction nitro et la protection subséquente de l’aniline comme carbamate Fmoc, (2) l’échange du groupe protecteur du groupe Boc incompatible vers un Alloc, et (3) l’enlèvement de PMB pour révéler le site pour l’immobilisation sur un support solide. La séquence était à haut rendement et pouvait être réalisée sur une échelle multigramme. Schéma 1 Avec tous les stéréoisomères de 4 préparés, nous avons tourné notre attention vers la production de bibliothèques. L’immobilisation de l’échafaud a d’abord impliqué l’activation des lanternes SynPhase avec de l’acide triflique pour donner le triflate de silyle, suivie d’une exposition avec l’échafaudage en présence de 2,6-lutidine (Schéma 2).Les niveaux de chargement typiques pour l’étape d’immobilisation étaient 15 – 18 μ mol / Lantern. L’élimination du groupe protecteur Fmoc dans des conditions standard suivies d’un coiffage avec des chlorures de sulfonyle, des isocyanates, des chlorures d’acide ou du formaldéhyde (27 blocs de construction ou benne) a introduit la première diversité d’appendices (R1) à l’aniline. La déprotection Alloc induite par le palladium en présence d’acide barbaturique a révélé la présence du second site de diversité des appendices (R2) à l’amine, qui a été coiffée de chlorures de sulfonyle, d’isocyanates, d’acides ou d’aldéhydes (29 blocs de construction). La libération du support solide a été obtenue avec HF / pyridine, ce qui a donné une moyenne de 14,1 μ mole de chaque composé final par lanterne. Toutes les combinaisons possibles de blocs de construction ont été utilisées pour chaque stéréoisomère (sauf où R1 = skip) pour fournir une bibliothèque de 6488 membres. Tous les composés ont été analysés par chromatographie liquide ultraperformance (UPLC), et les échantillons de pureté > 75% à 210 nm (5820 composés, taux de réussite de 90%) ont été soumis pour HTS.Scheme 2La bibliothèque basée sur SNAr a été incluse avec d’autres DOS et bibliothèques commerciales dans une campagne HTS conçu pour identifier les suppresseurs de l’apoptose cellulaire induite par les cytokines. La lignée de rat INS-1E23 de rat a été traitée dans un format de 384 puits avec cette banque en présence d’un cocktail de cytokines pro-inflammatoires (IL-1 et IFN – γ – α) pendant 48 h. La mesure basée sur la luciférase des taux cellulaires d’ATP a été utilisée comme substitut de la viabilité cellulaire.7 Plusieurs composés DOS ont partiellement restauré la viabilité cellulaire en présence de ces cytokines, et nous avons pu déterminer certaines caractéristiques SSAR du test primaire. . Comme le montre la figure 11.1, les lactames 4c et ent-4d étaient les stéréoisomères préférés, démontrant l’importance de la stéréochimie dans le cycle à huit chaînons. La stéréochimie 5R, 6R était nécessaire pour l’activité, tandis que la configuration du stéréocentre excocyclique était moins critique. Les substituants de l’urée semblaient être favorisés en position aniline, comparativement aux sulfonamides et aux amides. En position amine, les sulfonamides ont entraîné des taux d’ATP supérieurs à ceux des urées et des amines. (2S, 5R, 6R) -5 était le membre le plus puissant de la bibliothèque, avec une EC50 de 4.9 μ M dans la restauration β -cellabilité de la cellule.Figure 1 Données de dépistage primaires affichées comme pourcentage d’inhibition de la cellule bêta apoptose. Un total de 6488 composés dérivés de huit échafaudages SNAr stéréoisomères ont été testés. La matrice complète des blocs de construction pour R1 (axe des y) et R2 (axe des x) est représentée. Cellules vides … En utilisant le composé 5 comme point de départ, des SAR supplémentaires ont été explorés par la préparation d’une variété d’analogues et des tests subséquents pour la restauration des niveaux d’ATP cellulaire dans les cellules INS-1E comme une lecture. Nous avons d’abord exploré la nature du substituant urée en R1. Sur la base des résultats du criblage primaire, le substituant naphtyle volumineux semble être préféré aux groupements phényle simples; Nous nous sommes donc concentrés sur des modifications subtiles de l’anneau naphtyle. Comme le montre le tableau 1, la saturation du noyau naphtyle n’était pas tolérée (composés 6 et 7), pas plus que le remplacement par un cycle benzofurane (composé 8). Nous avons ensuite exploré les modifications du sulfamide à R2. Lorsque le groupe para-méthoxyle a été déplacé vers l’ortho- ou la méta-position (composés 9 et 10), l’activité a été abolie. Le remplacement par un groupe phénoxy plus volumineux (composé 11) a également entraîné une perte d’activité. La puissance a été conservée et même augmentée avec l’introduction d’analogues m, p-disubstitués (composés 12 et 13). Le composé 13 (BRD0476, sonde ML18724) en particulier était un suppresseur puissant de la mort cellulaire, donnant la meilleure performance parmi tous les analogues, avec une CE50 de 0,78 μ M et une activité maximale de 99%. La 2,3-dichlorophénylurée a également été synthétisée et testée (composé 14) pour explorer plus avant le remplacement du noyau naphtyle; Cependant, ce composé était inactif. L’élimination de l’alcool primaire n’a pas affecté l’activité (composés 15 et 16). Tableau 1EC50 (μ M) et activité maximale des analogues synthétisés dans la restauration β Viabilité -Cell L’analogue le plus puissant, composé 13 (BRD0476), a été choisi pour caractériser davantage ses effets sur différents aspects de la biologie cellulaire. L’activité de la caspase-3 est normalement très élevée dans les cellules apoptotiques. Les cytokines pro-inflammatoires ont induit une augmentation de 6,5 fois de l’activité de la caspase-3 (figure ​ figure 2A) .2A). Le traitement avec 13 en présence de cytokines réduit l’activité de la caspase-3 d’une manière dose-dépendante. IL-1 β est connu pour induire l’expression génique de l’oxyde nitrique synthase (iNOS), un effet qui est potentialisé par IFN – γ .25 La formation ultérieure de NO entraîne la mort cellulaire à la fois par la nécrose et l’apoptose.La production de nitrite est une mesure de substitution de l’oxyde nitrique générée par des cellules INS-1E traitées par des cytokines et est mesurée par colorimétrie en utilisant le réactif de Griess (un mélange disponible dans le commerce de dichlorhydrate de naphtylènediamine et de sulfanilamide). Le composé 13 induit une diminution dose-dépendante de la production de nitrite (figure ​ (figure 2B), 2B), bien que l’effet soit plus modeste que l’activité de la caspase-3. On a signalé que l’apoptose à médiation par la cytokine β -cell provoque une perte du potentiel de la membrane mitochondriale (Δ Ψ m). JC-1 est un colorant couramment utilisé pour mesurer Δ Ψ m. Le potentiel de la membrane mitochondriale a été réduit de 2,5 fois en présence de cytokines et a été restauré à des taux normaux par traitement avec le composé 13 (figure 2C) (figure 2C) .2C). Enfin, la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) est l’une des fonctions physiologiques les plus importantes des cellules #x003b2; Après une brève inanition suivie d’une provocation avec des taux de glucose élevés (16 mM), les cellules sécrètent de l’insuline dans le milieu de culture cellulaire. GSIS a été aboli après 2 jours de traitement avec des cytokines pro-inflammatoires; cependant, le traitement simultané avec 5 μ M composé 13 restauré GSIS à des niveaux presque normaux (figure ​ (figure22D) .Figure 2 effets cellulaires de 13 dans la mort β -cellule induite par les cytokines. (A) Effets de 13 sur l’activité de la caspase-3 après 48 h de traitement (B) Effets de 13 sur la production cellulaire de nitrite après 48 h de traitement (C) Effets de 13 sur la membrane mitochondriale … En résumé, nous avons développé Les résultats ont montré que l’analogue DOS amélioré 13 (BRD0476, sonde ML18724) protégeait les cellules des rats contre les cytokines pro-inflammatoires et peut représenter une stratégie viable de protection des cellules pancréatiques dans le contexte du diabète de type 1. Les efforts en cours portent actuellement sur l’identification du mécanisme d’action du composé principal, qui constituera la base d’une future publication. n | none