Les récentes cellules CD T des émigrants thymus prédisent la progression de la maladie VIH chez les patients atteints d’un VIH acquis périnatalement

Contexte La restauration immunitaire robuste dans le virus de l’immunodéficience humaine Les patients séropositifs dépend de la fonction thymique Cependant, peu d’études ont étudié la fonction thymique et sa corrélation avec la progression de la maladie chez les patients séropositifs au VIH. Méthodes Dans cette étude prospective longitudinale, nous avons suivi des patients séropositifs. Les cellules mononucléaires du sang périphérique ont été colorées avec des anticorps monoclonaux anti-CD et anti-CD et de récents émigrants thymiques CD récemment émigrés du thymus RTE, CDCD quantifié par cytométrie en flux. Analyse statistique utilisée Test de Wilcoxon rank sum, Kruskal-Wallis, corrélation de Spearman, et les estimations de Kaplan-Meier; Les modèles de régression de Cox ont été réalisés pour l’analyse longitudinaleRésultats L’âge médian des patients séropositifs recrutés était de quatre ans, le CDRTE% diminuait avec l’âge et était plus élevé chez les femmes. CDRTE médian était%, IQR, CDRTE% étroitement lié au CD% Les taux absolus mais indépendants de la charge virale et CDCD% La compliance antirétrovirale ainsi que le CD nadir supérieur ont été associés à une CDRTE plus élevée% CDRTE faible% prédit une mauvaise progression de la LV et CD% au fil du temps Conclusions Le CDRTE% prédit la progression de la maladie et peut refléter les antécédents pathologiques chez les patients séropositifs et les adolescents Ils sont faciles à mesurer en milieu clinique et peuvent être des marqueurs utiles pour orienter les décisions thérapeutiques

VIH, thymus, CD, patientsVirus d’immunodéficience humaine L’infection par le VIH peut causer des altérations marquées des capacités immunitaires qui sont en partie la conséquence de la production réduite de lymphocytes T Les objectifs centraux de la prise en charge clinique des patients Le succès clinique de ce bras de prise en charge est le plus souvent évalué en fraction de lymphocytes sanguins CD. Cependant, cette mesure ne permet pas de savoir si les cellules CD dénombrées sont d’origine périphérique ou thymique; Des cellules d’origine thymique sont nécessaires pour des capacités immunologiques plus robustes, fournissant un plus grand répertoire des récepteurs des lymphocytes T Pour traiter cela, des études ont été menées pour mesurer directement les cellules T émigrées du thymus RTE. dans quelques cas, le traitement peut restaurer la production de RTE Cependant, peu d’études ont évalué la RTE chez les patients des sites de soins primaires, en particulier chez les patients ayant acquis le VIH périnatale lorsque leur système immunitaire était immature. Pour être de bons marqueurs du contrôle de la maladie dans le VIH, de nombreuses études ont prouvé le rôle additif des autres marqueurs comme déterminants pronostiques de la progression de la maladie VIH, en particulier les marqueurs de l’activation immunitaire Cependant, il existe toujours un besoin de mesurer les marqueurs de la progression de la maladie , en particulier ceux qui peuvent refléter des interventions thérapeutiques réussies. Le rôle de la RTE dans la prédiction des résultats cliniques chez les patients séropositifs mérite une étude plus approfondie. Cela pourrait être particulièrement important pour les patients qui ont une maladie apparemment bien contrôlée pendant le traitement antirétroviral combiné cART, mais dont une fraction se détériorera par la suite. Plusieurs études ont montré que l’expression des CD sur les cellules CD diminue avec la maturation et se corrèle bien avec le contenu TREC, ce qui en fait un marqueur acceptable des cellules CDRTE Parce que CD est exprimé sur la surface des cellules CD et la méthodologie pour mesurer les marqueurs de surface sur les cellules CD, y compris CD, sont des composants de routine de la gestion clinique des patients VIH, il est possible que l’ajout d’un seul réactif à un informations sur les cellules CDRTE pour les patients pédiatriques dans les milieux cliniques Nous avons émis l’hypothèse que CDRTE% moi Nous avons donc mesuré de façon prospective le taux de CDRTE% dans une population de patients infectés par voie périnatale et d’adolescents fréquentant une clinique pédiatrique spécialisée dans le VIH.

Méthodes

Les patients

L’étude a impliqué des patients séropositifs, infectés périnatalement, recevant des soins par la Clinique VIH pédiatrique d’UTHealth, Houston, Texas. Pendant la période d’étude, la clinique a fourni des services aux patients séropositifs et aux adolescents. a refusé, dont a assisté le laboratoire clinique qui a collaboré à fournir des échantillons pour cette étude des échantillons de sang ne pouvaient pas être obtenus ou étaient de mauvaise qualité pour les patients qui ont assisté au laboratoire clinique collaboratif The Institutional Review Board of UTHealth a approuvé l’étude recueillies à chaque visite clinique régulière entre janvier et septembre Les données cliniques et de laboratoire ont été extraites des dossiers médicaux

Phénotypage lymphocytaire

Des cellules mononucléaires de sang périphérique ont été isolées à partir de sang entier additionné d’anticoagulant EDTA en utilisant un milieu de séparation de lymphocytes du commerce MP Biomedical, LLC Un total de cellules ont été colorées en surface pendant minutes à ° C dans l’obscurité avec ClC anti-CD conjugué à PerCP-Cy. , BioLegend, San Diego, Californie et anti-CD Clone MBC [R-PECAM] conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine, Invitrogen, Carlsbad, Californie, puis lavés et remis en suspension dans une solution tamponnée au phosphate A FACSCalibur BD Biosciences a été utilisé pour l’acquisition des données. Utilisation du logiciel FlowJo, version Tree Star, Inc Figure supplémentaire présente la stratégie de déclenchement

Analyses

Les patients ont été classés en groupes représentant leur statut clinique par rapport à la maladie VIH au début de l’inscription et la collecte du premier échantillon sanguin. Les patients classés en état cliniquement satisfaisant avaient un CD ≥% et un ARN du VIH indétectable dans le plasma & lt; Copies d’ARN du VIH / mL Patients en état cliniquement médiocre Le patient présentait un CD & lt;% et ≥ Copies d’ARN du VIH / mL Patients en état cliniquement intermédiaire La ponction avait un CD ≥% et ≥ Copies d’ARN du VIH / mL Un patient avait CD & lt;% et & lt; Les patients étaient considérés comme sous traitement s’ils recevaient un inhibiteur de la transcriptase inverse à double nucléoside-nucléotide avec un inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse ou un inhibiteur de la protéase sans interruption pendant au moins des mois. Avant la mesure de la CDRTE de base La durée totale de l’exposition aux antirétroviraux était exprimée sous forme de durée cumulée en jours de traitement par antirétroviraux. Les patients étaient considérés comme naïfs s’ils n’avaient jamais reçu de TARV auparavant. Spearman ρ a été utilisé pour calculer les corrélations, et des tests de rangs signés Mann-Whitney U, Kruskal-Wallis et Wilcoxon ont été utilisés pour les comparaisons Un modèle de régression linéaire a été utilisé pour calculer les corrélations. déterminer des prédicteurs indépendants de C Les tests de ratio de vraisemblance ont été utilisés pour comparer les modèles et déterminer le meilleur ajustement dans une méthode pas à pas vers l’arrière pour étudier la capacité du CDRTE% à prédire l’évolution clinique, les estimations de Kaplan-Meier, les tests de log-rank univariés et les modèles de régression calculé pour les résultats: détérioration de l’état clinique et amélioration de l’état clinique Un événement clinique se détériorant a été défini parmi les patients de référence Cgood et Cint comme toute visite de suivi avec CD & lt;% et ≥ copies d’ARN VIH / mL Cpoor Un événement clinique améliorant a été défini parmi les patients de base Cpoor et Cint comme toute visite de suivi avec CD ≥% et & lt; Copies d’ARN du VIH / mL Cgood Les hypothèses des risques proportionnels et des effets covariants variables dans le temps ont été évaluées graphiquement. Une valeur de P & lt; a été considéré comme statistiquement significatif

RÉSULTATS

Les données démographiques, cliniques et de laboratoire à partir de la ligne de base sont présentées dans le tableau Comme prévu, CDRTE% corrélé négativement avec l’âge ρ = – [P & lt; ] Les valeurs de CDRTE% étaient légèrement plus élevées chez les femelles que chez les mâles; la différence approche les médianes de signification statistique [intervalle interquartile =] et [intervalle interquartile =], respectivement, P =

Tableau Données démographiques et de laboratoire démographiques à la base Résultat Tous VIH Séropositif Statut clinique Groupe Pa Pa Pa Cpour Ct Cgood N Âge y Femme Noir CD CD% b & lt; & lt; Cellule CDAbs / μL & lt; & lt; CDRTE% Cellule CDRTEAbs / μL & lt; & lt; CD% Nadir & lt; Cellule CDAbsNadir / μL & lt; Rapport CD / CD & lt; & lt; CD CD% & lt; Cellule CDAbs / μL CDCD% CDHLA-DR% & lt; VIH VL LogVL Indétectable & lt; & lt; VLc journalier moyen Traitement Âge à l’initiation y cART Oui Non, ART interrompu Non, ART naïf Résultat Tous VIH Positif VIH Statut clinique Groupe Pa Pa Pa Cpauvre Ctint Cgood N Âge y Femme Noir CD CD% b & lt; & lt; Cellule CDAbs / μL & lt; & lt; CDRTE% Cellule CDRTEAbs / μL & lt; & lt; CD% Nadir & lt; Cellule CDAbsNadir / μL & lt; Rapport CD / CD & lt; & lt; CD CD% & lt; Cellule CDAbs / μL CDCD% CDHLA-DR% & lt; VIH VL LogVL Indétectable & lt; & lt; VLc quotidien moyen Traitement Âge à l’initiation y cART Oui Non, ART interrompu Non, ART naïf Les valeurs sont les médianes intervalles ou comptages interquartiles% Abréviations: Abs, absolu; ART, thérapie antirétrovirale; cART, thérapie antirétrovirale combinée; Bon, cliniquement bon état; Cint, statut cliniquement intermédiaire; Cpoor, statut cliniquement pauvre; VIH, virus de l’immunodéficience humaine; RTE, récemment émigré du thymus; VL, loadaP viral, valeur P pour les comparaisons entre les groupes Cpoor et Cint; P, Cpoor et Cgood; P, Cint et Cgood Les valeurs P significatives sont en grasb Les valeurs en italique sont en dehors du domaine clinique normal du laboratoire Pour estimer l’ARN du VIH plasmatique cumulé, on calcule une VL journalière moyenne géométrique Le log de chaque VL rapportée du premier test VL de chaque patient jusqu’à la ligne de base le test est déterminé, et la règle trapézoïdale est utilisée pour estimer la VL journalière entre les mesures La somme de ces valeurs journalières est divisée par le nombre cumulé de jours entre la première et la plus récente mesure VL.

Associations de base CDRTE% avec l’histoire du patient et les résultats de laboratoire de base sélectionnés

Nous avons utilisé l’analyse de corrélation pour tester les relations univariées entre les CD RTE% au départ, les autres résultats mesurés sur le même échantillon sanguin et les résultats sélectionnés comme indicateurs de l’histoire de la maladie VIH de chaque patient

CDRTE% se corrèle positivement avec CD et est indépendant de la charge virale

Les résultats ont démontré des corrélations positives fortement significatives entre le pourcentage de CDRTE et d’autres mesures contemporaines de cellules CD, y compris CD% r =; P & lt; et CD: rapport CD r =; P = Baseline CDRTE% a montré des corrélations positives tout aussi fortes avec le nombre de CD nadir r =; P & lt; ; C’est une valeur qui, dans la plupart des cas, est survenue plusieurs années avant la mesure du CDRTE de référence. Les associations de CDRTE% avec les mesures contemporaines des cellules CD n’étaient pas aussi fortes mais atteignaient une signification pour une relation négative avec CD% r = -; P = et le sous-ensemble CDHLA-DR% r = -; P = Contrairement à CDHLA-DR%, un second marqueur de l’activation du système immunitaire, CDCD%, n’a montré aucune relation avec CDRTE% r =; P = L’analyse n’a révélé aucune corrélation significative entre le pourcentage de CDRTE et la virémie VIH contemporaine r = -; P =, historique cumulatif VL r =; P =, ou pic historique VL r = -; P =

Le pourcentage de CDRTE chez les enfants infectés par le VIH et ayant une infection périnatale est prédit par traitement et, dans une moindre mesure, par Nadir CD%

Cinquante-six% des patients étaient sous TARTE et n’étaient pas sous TARV à la ligne de base Sans TARTE, n’avaient jamais reçu de traitement ARV naïf, progressaient lentement et avaient été traités par TART mais avaient des problèmes de conformité interrompus traitement Bien qu’ils soient plus jeunes en moyenne, antirétroviraux les patients avaient un pourcentage de CDRTE plus faible que les patients avec un traitement interrompu et les patients avec un TARa Les différences entre les groupes TAR et nART proches de la signification statistique P = malgré le petit nombre de patients dans le groupe naïf ART

Tableau CDRTE% et Âge par traitement Groupe Résultat Antécédents ART Pa Pa Pa Naif Interrompu cART N SO SO SO CDRTE% Âge Résultat Antécédents ART Pa Pa Pa Naive Interrompu cART N SO NA NA CDRTE % Age Les valeurs sont les médianes et les intervalles interquartiles. Abréviations: ART, thérapie antirétrovirale; cART, thérapie antirétrovirale combinée; NA, non applicable; RTE, récemment émigré à partir des listes thymusaP P pour les comparaisons entre ART naïf et ART interrompu; P est pour ART naïf et cART; Un modèle de régression linéaire multivariée avec CDRTE% en tant que variable dépendante a été construit. Après avoir contrôlé les associations entre les CDRTE% par âge et par sexe, le modèle a confirmé la réduction significative du nombre de CDRTE en fonction de l’âge et du sexe. CDRTE% parmi les patients naïfs de traitement et une réduction mineure chez les patients avec un traitement interrompu par rapport à ceux sur le tableau cART Bien que la signification approche, CDRTE% reste positivement associé au nadir CD% comme variable suivante la plus influente dans la prédiction CDRTE% Ethnicity, HIV clinique groupe d’état, CD%, CDCD%, CDHLA-DR% et CD: CD rapport n’a pas montré une association significative avec CDRTE% après ajustement pour l’âge, le sexe, l’état du traitement, et nadir CD%

Tableau Récapitulatif de l’analyse de régression linéaire Prédiction de CDRTE% Variable B SE β P Valeur Femme Âge y – – Groupe de traitement Interrompu – – Naïf – – Nadir CD% Constante NA & lt; Variable B SE β P Valeur Femme Age y – – Groupe de traitement Interrompu – – Naive – – Nadir CD% Constante NA & lt; Les variables indépendantes initiales incluaient l’âge, le sexe, l’appartenance ethnique, le groupe d’état clinique du virus de l’immunodéficience humaine, CD%, CDCD%, CDHLA-DR%, CD: CD ratio, état du traitement et nadir CD% Variables non significatives supprimées à partir du modèle de façon graduelle et les rapports logarithmiques de vraisemblance ont été calculés pour comparer les modèles avant et après la suppression de chaque variable afin de s’assurer qu’aucun changement significatif du modèle ne se produisait P valeur & lt; pour le test du rapport de vraisemblance Nous avons retenu toutes les variables avec une valeur de P & lt; dans le modèle Statistiquement significatif P & lt; les associations avec CDRTE% sont en grasLes groupes de traitement ont été codés en tant que variables catégorielles avec la catégorie de base étant la thérapie antirétrovirale combinée. La catégorie de base pour le sexe était Nadir CD% et l’âge ont été utilisés comme variables continues. Abréviations: β, coefficients de régression normalisés; B, coefficient de régression non normalisé; NA, non applicable; RTE, récemment émigré du thymus; SE, erreurs standard des coefficients non normalisésView Large

Études longitudinales des cellules CDRTE

Le CDRTE% au départ prévoit un changement au fil du temps dans le groupe d’état clinique des maladies VIH

Pour identifier les valeurs de CDRTE% associées à l’amélioration ou à la détérioration de l’état clinique de la maladie VIH, les patients avec un statut clinique VIH Cpoor ou Cgood et avec au moins un échantillon sanguin supplémentaire après la ligne de base ont été évalués pour changement clinique pendant la durée de l’observation digestif. Les patients qui ont montré une amélioration avaient un score CDRTE médian de base de%, ce qui est% plus élevé que pour ceux qui sont restés dans la classification Cpoor réciproquement, Les patients ayant présenté une détérioration clinique présentaient un CDRTE% médian de% au départ, soit un pourcentage inférieur à celui de ceux qui ont présenté une détérioration clinique. reste dans la classification de Cgood Ces résultats suggèrent que les patients avec CDRTE% plus grand ou égal à environ% dans un échantillon de sang sont plus susceptibles de montrer une amélioration clinique ultérieure, tandis que ceux avec moins de% environ CDRTE% sont plus susceptibles de se détériorer cliniquement

CDRTE &%% Prédit Indépendamment de la Détérioration du Statut Clinique du VIH

Les variables cliniques de base prédictives des résultats longitudinaux de la maladie ont été identifiées en utilisant des modèles de régression multivariée de Cox comprenant des patients de référence Cgood et Cint pour évaluer la détérioration et des patients Cpoor et Cint de base pour évaluer une amélioration faible CDRTE% & lt;% et CDHLA-DR & g% significativement Figure A et B Alternativement, l’état du traitement prédisait l’amélioration de l’évolution clinique. Figure C de sorte que, des% patients de référence Cpoor et Cint qui se sont améliorés au statut de Cgood pendant le suivi, tous recevaient activement Chez ces patients Cpoor et Cint recevant cART au départ, CDHLA-DR% prédisait significativement une amélioration de l’état clinique. Figure D CDRTE élevé% ≥% et faible CD% & lt;% au départ ont montré une association univariée à une amélioration de l’état clinique -up mais ne reste pas significatif dans le modèle multivarié

Figure Vue largeTélécharger les diapositives A et B, Prédicteurs significatifs de la détérioration: les patients passent d’un état meilleur que cliniquement faible à l’état initial à Cpoor pendant le suivi C et D, Prédicteurs significatifs de l’amélioration: patients en transition de moins que cliniquement bon état. Cgood pendant le suivi Abréviations: ART, thérapie antirétrovirale; cART, thérapie antirétrovirale combinée; RTE, récemment émigré du thymusFigure Vue largeTélécharger les diapositives A et B, Prédicteurs significatifs de la détérioration: patients passant d’un état meilleur que cliniquement faible à l’état initial à Cpoor pendant le suivi C et D, prédicteurs significatifs d’amélioration: patients transitionant de moins que cliniquement Bon état Cgood au départ à Cgood pendant le suivi Abréviations: ART, traitement antirétroviral; cART, thérapie antirétrovirale combinée; RTE, récemment émigré du thymus

DISCUSSION

le fait que les virus résistants soient moins virulents et moins susceptibles de provoquer une immunosuppression malgré une virémie persistante Les thymocytes ont été décrits comme résistants à l’entrée du virus VIH résistant aux inhibiteurs de la protéase Il a également été décrit précédemment que les TREC ne sont pas corrélés avec VL chez les patients sous traitement pendant une période prolongée Cela pourrait expliquer la découverte dans notre population, car la plupart des patients avaient été traités par le cART pendant des années à l’étude. Klein et al n’ont trouvé aucune perte préférentielle de cellules CD parmi les cellules CD naïves. En conclusion, l’activation immunitaire doit contribuer à cette diminution en plus de la diminution possible de la fonction thymique Dans notre étude, la fonction thymique mesurée en CDRTE était indépendante de l’activation immunitaire mesurée en CDCD%. mais pas comme mesuré par CDHLA-DR% CD mesurée sur les cellules CD a été suggéré de prédire indépendamment la réponse à la thérapie et le progrès de la maladie ssion chez les patients et les adultes Fait intéressant, CDRTE% n’a pas suivi le même schéma de variation que la CDCD% lorsque les groupes cliniques ont évolué avec le temps et n’ont pas corrélé avec CDCD% globalement dans notre étude Discordance entre expression CD et expression HLA-DR sur les lymphocytes T CD a été décrite, avec l’existence de cellules CDCD-HLA-DR, CDCDHLA-DR-, et CDCDHLA-DR CD et HLA-DR semblent être exprimés sur des cellules T CD à des stades différents mais partiellement chevauchants de leur développement et maturation CD est exprimé sur les cellules CD naïves immatures ainsi que sur les cellules mémoires activées , alors que HLA-DR est uniquement exprimé sur les cellules T CD activées et stimulées L’expression HLA-DR est corrélée négativement avec la teneur en TREC des cellules T CD Cela pourrait expliquer la corrélation négative que nous avons trouvé entre CDHLA-DR% et CDRTE% CDHLA-DR% a été récemment décrit comme significativement plus élevé que CDCD% chez les patients contrôleurs VIH et d’avoir une expression plus élevée CD T légèrement stimulé Ces résultats combinés avec les nôtres suggèrent que HLA-DR a une certaine particularité / supériorité par rapport à la CD dans la prédiction de la progression de la maladie, ce qui pourrait être lié à une augmentation de la concentration de HLA-DR. Dans cette étude, CDHLA-DR% et CDRTE% ont tous les deux prédit une détérioration de la maladie à VIH, telle que déterminée par le changement de CD et de VL. Cependant, le pourcentage de CDRTE était le plus élevé. marqueur de pronostic puissant pour prédire une telle détérioration P = CDRTE% chez les patients VIH-positifs dans notre étude dépendait principalement de l’état du traitement et du nadir CD% Ceci souligne l’importance du traitement dans le maintien et le rétablissement de la fonction thymique. l’entrée dans l’étude, mais avec des antécédents de traitement, a eu un taux de CDRTE supérieur à celui des patients naïfs malgré un nombre de CD et une VL relativement bons. o soutenir le début du traitement chez les patients chez qui aucune autre indication évidente de traitement n’est présente Une autre conclusion qui soutient l’initiation précoce du traitement est que les patients du groupe Cgood étaient significativement plus jeunes au début du TART que ceux du groupe Cpoor. et al, nous avons trouvé nadir CD% pour corréler avec CDRTE% et avoir un rôle proche de significatif dans la prédiction de sa valeur L’importance de nadir CD% et historique du traitement dans la prédiction de CDRTE% souligne que RTE reflète l’histoire de la maladieLe reste de nos résultats En particulier, ce qui se rapporte aux différences de RTE entre les patients virémiques et avirémiques et les changements avec l’âge, ne concordent pas avec les résultats de Blanche et al Cette discordance est partiellement due aux différences dans les populations. la littérature précédemment publiée exprimait RTE comme une sous-population de cellules CD, alors que Blanche et al exprimaient RTE en pourcentage de cellules CD naïves s, rendant leurs données difficiles à comparer avec les nôtres et celles des autres Nous avons trouvé CDRTE% pour prédire l’évolution du statut virologique et immunologique des patients Ceci est basé, en partie, sur les résultats de l’analyse de survie mais aussi montré par La taille des petits groupes peut avoir expliqué la signification non statistique de certaines de ces observations Dans une étude sur les adultes, les RTE ont été jugés inappropriés comme marqueur de la récupération des CD . D’autre part, Li et al ont récemment montré CD exprimé sur les cellules CD naïves au début du traitement pour prédire le taux de récupération de CD chez les adultes séropositifs pour le VIH Notre constatation que CDRTE% à tout moment peut prédire la détérioration du groupe clinique dans Les patients séropositifs sont nouveauxLa dynamique et le manque d’homogénéité de notre population ont peut-être limité la signification de certaines de nos observations. Nos résultats n’étaient pas toujours significatifs en raison de la petite taille de l’échantillon de certains de nos patients. groupes

CONCLUSION

Dans notre étude, CDRTE% reflète l’histoire du VIH, y compris l’histoire d’exposition cART et nadir CD% CDRTE baseline% prédit indépendamment échec CD et VL Ce sous-ensemble facilement mesurable de cellules T CD peut ainsi guider le clinicien dans la prise de décision liée au traitement, y compris l’introduction d’un adjuvant traitement pour augmenter le rendement thymique et pour déterminer le pronostic du patient Les informations fournies par les mesures en% CDRTE semblent être indépendantes / incrémentales de celles fournies par d’autres valeurs de laboratoire mesurées de façon courante

Remarques

Remerciements Nous remercions nos patients, sans qui ce travail n’aurait pas été possible. Nous remercions également le personnel clinique et de laboratoire qui a rendu possible le prélèvement sanguin. Soutien financier Ce travail a été soutenu par l’Initiative VIH du TexasPerspectives d’intérêts potentielles Tous les auteurs: ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits potentiels de conflits d’intérêts que les éditeurs jugent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués