Les marqueurs de l’infection virale chez les jumeaux monozygotes discordants pour le syndrome de fatigue chronique

Afin d’estimer la prévalence des virus associés au syndrome de fatigue chronique et de contrôler les facteurs génétiques et environnementaux, nous avons mené une étude sur les jumeaux jumeaux monozygotes, dont un jumeau répondait aux critères du SCF et l’autre était sain. Des réactions de PCR en chaîne pour l’ADN viral ont été réalisées sur des échantillons de cellules mononucléaires du sang périphérique pour détecter une infection par HHV-, HHV-, HHV-, cytomégalovirus , Virus Epstein-Barr, virus herpes simplex, virus varicelle-zona, virus JC, virus BK et parvovirus B Pour détecter une infection lytique, le plasma a été testé par PCR pour l’ADN du virus HHV, HHV, cytomégalovirus et Epstein-Barr, et la salive a été examinée pour l’ADN HHV- Pour tous les tests, les résultats ne différaient pas entre le groupe de jumeaux avec CFS et les jumeaux en bonne santé

Syndrome de fatigue chronique Le syndrome de fatigue chronique est caractérisé par une fatigue qui dure ⩾ mois et s’accompagne de troubles du sommeil, de la fonction cognitive, de douleurs musculo-squelettiques et d’autres symptômes Diagnostic d’exclusion basé sur les symptômes. qui est rapporté le plus fréquemment chez les sujets féminins Les caractéristiques cliniques fréquentes du SFC, telles que début brusque avec fièvre, adénopathie , et symptômes pseudo-grippaux , associées à des caractéristiques épidémiologiques compatibles avec les épidémies , suggèrent que le SFC peut être le résultat d’une infection virale Bien que des études antérieures aient montré que les différentes mesures de l’infection virale ne distinguent pas systématiquement les patients du SFC , ces études n’ont généralement pas mesuré directement la persistance ou la réplication du virus. détection d’acide nucléique Au lieu de cela, l’accent a été mis sur l’évaluation de la séroprévalence ou des indicateurs indirects de réplicats viraux. En outre, les recherches antérieures n’ont pas suffisamment contrôlé le rôle des facteurs génétiques ou de l’hôte et les expositions environnementales, ce qui rend difficile de tirer des conclusions définitives sur le rôle des virus dans l’alternative CFSO aux études traditionnelles comparant Les patients atteints du SFC de groupes témoins sains, déprimés ou chroniques qui sont génétiquement dissemblables et ont des antécédents d’exposition différents est une étude de co-jumelage acidose. Il s’agit d’un modèle à paire appariée qui s’adapte parfaitement aux facteurs génétiques et partiellement environnementaux. Nous avons entrepris une étude de co-jumeaux pour examiner la relation entre le SCF et les marqueurs de l’infection virale chez des paires de jumeaux monozygotes qui étaient discordantes pour le SCF. Nous avons effectué des tests sérologiques pour les anticorps dirigés contre l’herpèsvirus humain HHV- , le cytomégalovirus CMV, le virus de l’herpès simplex HSV et le virus de l’hépatite C VHC ys pour l’ADN viral qui a testé des échantillons de PBMC de cellules mononucléaires du sang périphérique pour détecter l’infection par des virus connus comme latents dans ce compartiment, y compris les virus HHV, HHV, HHV, CMV et Epstein-Barr EBV, ainsi que des virus non établis. Pour détecter une infection lytique, des échantillons de plasma ont été testés par PCR pour l’ADN des HHV, HHV, CMV et EBV, et des échantillons de salive pour détecter une infection lytique, par exemple un virus HSV, virus ont été examinés pour l’ADN HHV-

Patients, matériaux et méthodes

Construction du registre et recrutement des sujets

Les patients jumeaux, dont un ou les deux ont signalé une fatigue persistante, ont été recrutés pour participer à un registre jumeau volontaire par le biais de bulletins de groupe de soutien aux patients% de participants, de cliniciens et de chercheurs familiers avec CFS%, d’organismes jumeaux et de chercheurs %, parents et amis%, et autres sources% Des questionnaires d’admission ont été postés aux individus, dont% les ont retournés Des données complètes étaient disponibles pour les deux membres de paires jumelles Le questionnaire a recueilli des informations sur la démographie, la zygosité, le mode de vie, la nature et l’étendue de la fatigue, et une liste des symptômes du SFC Les jumeaux qui n’ont pas signalé de fatigue persistante ont rempli un questionnaire de contrôle qui ne faisait pas référence à la fatigue. Tous les jumeaux ont fourni un consentement éclairé.

Troubles psychiatriques

L’entrevue diagnostique Version III-A , une entrevue structurée basée sur le Manuel diagnostique et statistique des troubles mentaux, édition révisée , a été administrée par téléphone Les sections incluaient la dépression majeure, la dysthymie, l’anxiété généralisée, la panique, l’agoraphobie, trouble de stress post-traumatique, manie, troubles bipolaires, schizophrénie, troubles de l’alimentation, somatisation, toxicomanie et dépendance

Sélection de l’échantillon clinique

A partir du registre double, des ensembles de jumeaux monozygotes ont été choisis pour une évaluation d’une journée. Les jumeaux devaient avoir ⩾ ans; avoir été élevé ensemble; être discordant avec le SCF, c.-à-d. qu’un jumeau satisfaisait aux critères du Centre de contrôle et de prévention des maladies pour le SCF et que l’autre était en bonne santé et refusait la fatigue chronique; fournir la preuve d’un test négatif récent d’anticorps anti-VIH; cesser d’utiliser de l’alcool, de la caféine et tous les médicaments connus pour affecter la fonction immunitaire ou inflammatoire ⩾ semaines avant l’évaluation; Pour être en mesure de voyager à Seattle en même temps pour l’évaluation Tous les jumeaux ont été rigoureusement sélectionnés Pour les jumeaux souffrant de fatigue, la liste de contrôle des symptômes et les diagnostics générés par le programme d’entrevue diagnostique ont été utilisés pour déterminer si les critères CFS étaient remplis. Les problèmes de santé ont été résolus par téléphone ou par un médecin avant l’évaluation Un psychologue et un spécialiste des maladies infectieuses ont revu les dossiers de façon indépendante et approuvé les jumeaux avant la visite prévue. La zygosité a été initialement déterminée par des méthodes validées d’auto-évaluation, puis confirmée par l’analyse du polymorphisme de longueur de fragment de restriction. L’ADN a été extrait des PBMC et digéré. avec HaeIII, séparés par des électrophorèses d’agarose s, buvardé sur une membrane de nylon, et hybridé avec des sondes répétées en tandem à nombre variable pour déterminer la monozygotie avec une certitude de ⩾

Spécimens, dépistage sérologique des virus et détection des acides nucléiques viraux

Des échantillons de sang ont été recueillis dans des tubes anticoagulés, pour l’isolement du plasma et des PBMC, et dans des tubes non anticoagulés, pour la récupération des cellules sériques PBMC × ont été congelés dans μL de PBS. Les échantillons de plasma, de PBMC et de salive ont été conservés à – ° C. Les anticorps anti-VHC ont été détectés par ELISA Abbott Les anticorps anti-VHC et anti-HSV ont été détectés par immunoblot Les anticorps dirigés contre le VHC ont été détectés par ELISA EIA, Abbott Des anticorps IgM dirigés contre le parvovirus B ont été détectés par ELISA Specialty LabsL’analyse virale des acides nucléiques a été réalisée sur des échantillons de plasma, de PBMC et de salive à partir de plasma et de salive μL avec le kit sanguin Qiagen et de PBMC avec le kit Qiagen DNA Qiagen de salive et le sang a été remis en suspension dans et μL d’eau, respectivement, avec ~ μL d’ADN par réaction de PCR Pour PCR PBMC, chaque réaction contenait de l’ADN extrait de × PBMC Pour les sujets avec sérum anti-HCV réactif, l’ARN plasmatique a été préparé et la détection d’ARN a été effectuée par un test d’ADN ramifié Quantiplex; ChironDNA PCR a été réalisée en double Pour tous les échantillons, à l’exception de ceux des paires les plus récemment étudiées, le produit PCR a été détecté par hybridation liquide. Les méthodes publiées et les amorces ont été utilisées pour HHV- , HHV- , HHV – , CMV , EBV , HSV et virus BK Pour le VZV, les amorces étaient ‘-TCCGTTCTGGGTTCTGGTTGA-‘ et ‘-GCGCGGGGTCGCCTGATACTT-‘, et la sonde était ‘-ACCACCCGGGCCCTGTGTTCG-‘ Pour JC virus, les amorces étaient ‘-AGTCTTTAGGGTCTTCTACC-‘ et ‘-GGTGCCAACCTATGGAACAG-‘, et la sonde était ‘-GATGATGAAAACACAGGATCCCAACACTC-‘ Pour le parvovirus B, les amorces étaient ‘-TGAAAACTGGGCAATAAACTACAC-‘ et ‘-CTGCTGCTGATACTGGTGTCTGTG-‘, et la sonde était ‘ -TGCCCTCCACCCAGACCTCCAAACCA- Des inhibiteurs de PCR ont été détectés avec des témoins de drosophile, comme décrit ailleurs Chaque analyse PCR comprenait un échantillon témoin standard contenant l’ADN plasmidique qui comprenait la séquence cible dans des dilutions logarithmiques sérielles, ainsi qu’un témoin ne contenant pas d’ADN La limite inférieure de détection était généralement – Copies d’ADN par réaction A être rapporté comme ayant un résultat «positif certain», les deux réactions nécessaires pour détecter des copies par réaction de l’ADN cible avec & lt; Les copies détectables et celles pour lesquelles une seule PCR était positive étaient rapportées comme ayant un résultat « faiblement positif » Si l’ADN était détecté dans le contrôle négatif, la PCR était répétée. Pour les échantillons les plus récents, la technologie Taqman était utilisée pour détecter les produits PCR, comme décrit ailleurs, pour les méthodes PCR HHV- , HHV- , HHV- , CMV , EBV et HSV pour VZV et JC étaient similaires Tous les tests de virus BK ont utilisé la PCR en temps réel Inhibition de la PCR a été détectée avec un contrôle de coamplification in-well Brièvement, chaque puits de réaction contenait des copies de EXO DNA, nM des amorces EXOF / R et nM de la sonde EXO-P, qui s’hybridaient au produit EXO PCR et a été marqué avec VIC et TAMRA-carboxytétraméthylrhodamine; tous les puits de Applied Biosystems n’ayant pas réussi à produire un signal positif pour l’EXO étaient considérés comme contenant un inhibiteur de la PCR; Dans ce cas, l’ADN a été extrait une seconde fois et la PCR a été répétée. Des échantillons de contrôle ont été traités avec chaque lot d’échantillons pour assurer la récupération de l’ADN. Pour surveiller les faux positifs, le PBS × a été coprocédé Étape de PCR

analyses statistiques

Comme le nombre de jumeaux discordants pour la détection du virus était trop faible pour permettre l’utilisation du test de McNemar, des intervalles binomiaux exacts pour la probabilité que le jumeau du SFC était positif pour le virus ont été utilisés pour le test de McNemar. des paires discordantes pour obtenir des IC% pour les ORs comparant les jumeaux sains et CFS Si le% CI pour la RO inclus, les jumeaux CFS ne différaient pas significativement de ceux sans CFS Les analyses ont été faites avec S-Plus Insightful et SPSS SPSS

Résultats

Recrutement et sélection de sujets

Parmi les paires de jumeaux dépistées,% étaient discordantes pendant ⩾ mois de fatigue. Parmi ces paires,% étaient monozygotes et disposaient de données complètes; Cependant, les paires n’ont pas été inclus en raison de maladies psychiatriques d’exclusion, en raison de troubles médicaux, et en raison d’un indice de masse corporelle & gt; Par paires, le jumeau souffrant de fatigue ne répondait pas aux critères des symptômes du SFC Par paires, le jumeau sans fatigue présentait une affection excluant le SFC, par exemple le cancer, et les paires étaient exclues pour d’autres raisons. paires restantes dans lesquelles un jumeau répondait aux critères pour CFS et l’autre jumeau était en bonne santé et a nié la fatigue chronique,% a terminé l’étude,% a refusé de participer,% n’a pas pu être programmé, et% n’a pas pu interrompre les médicaments. ou état fonctionnel mental, tel que mesuré par l’échelle de Santé Formulaire Minime , entre les paires jumelles avec le SCF qui se sont rendues à Seattle pour évaluation et celles qui ne l’ont pas

Caractéristiques démographiques et cliniques

L’âge moyen des jumeaux au moment de l’étude était de plusieurs années; les couples étaient des femmes; et tous les jumeaux étaient blancs et avaient été élevés ensemble Il n’y avait aucune différence entre le groupe de jumeaux avec CFS et les jumeaux sans CFS dans la proportion qui étaient mariés% vs% Il y avait une petite différence statistiquement significative dans les années moyennes de scolarité des jumeaux avec CFS, années; jumeaux sans CFS, années; P ⩽ Les jumeaux avec CFS avaient une durée moyenne de maladie des années

Tests de virus

Les virus infectieux les plus fréquemment détectés étaient CMV et HSV- [%] pour chacun et HSV- [%] du tableau HHV- l’infection a été détectée chez des jumeaux en bonne santé. L’un avait des anticorps contre les antigènes HHV latents, mais pas lytiques. Un jumeau en bonne santé avec un test réactif pour les anticorps contre le VHC présentait des taux normaux de transaminases, aucun antécédent d’hépatite et des taux d’ARN du VHC indétectables pour la comparaison des résultats des tests sérologiques pour les jumeaux en bonne santé. avec ceux pour les jumeaux avec CFS ne diffèrent pas de manière significative de

Tableau Détection de l’infection virale dans des échantillons de sérum prélevés sur des jumeaux monozygotes discordants pour syndrome de fatigue chronique CFS Groupe HHV- CMV HSV- HSV- HCV Par statut CFS Jumeaux avec CFS n = Jumeaux en bonne santé n = a b Tous les jumeaux n = Comparaison de n = – – – – – Par résultat d’analyse virale Négatif pour les deux jumeaux n = Positif pour les deux jumeaux n = Positif pour le jumeau avec CFS et négatif pour le jumeau sain n = Positif pour jumeau sain négatif pour le jumeau avec CFS n = groupe sujet HHV- CMV HSV-HSV-HCV par statut CFS Jumeaux avec CFS n = jumeaux en santé n = a b Tous les jumeaux n = Comparaison des jumeaux avec CFS vs jumeaux en bonne santé, OR% CI n = – – – – – Par résultat d’analyse virale Négatif pour les deux jumeaux n = Positif pour les deux jumeaux n = Positif pour double avec CSA et négatif pour n = jumeau sain positif pour jumeau sain et négatif pour double avec CSA n = NOTE Les données ne sont pas des sujets, sauf indication contraire du CMV, cytomégalovirus; VHC, virus de l’hépatite C; HHV, herpesvirus humain; HSV, virus de l’herpès simplexa Chez les jumeaux, qui ont sécrété l’ADN HHV dans la salive, des anticorps latents et lytiques ont été détectésLes échantillons plasmatiques étaient négatifs pour le VHCRNAView LargeIl n’y avait aucune différence entre les jumeaux avec CFS et les jumeaux en bonne santé concernant le taux de détection des virus latents tableau Globalement, les β-herpesvirus étaient le virus infectieux le plus commun détecté dans les PBMC HHV- a été détecté en% des spécimens; % des résultats positifs ont été classifiés «positifs positifs» HHV – a été détecté dans les PBMC de% des jumeaux% de jumeaux avec CFS; % de jumeaux sans CFS CMV ADN a été détecté dans% des échantillons, y compris d’un jumeau avec CFS et d’un jumeau sain. Pour twin avec CFS, l’ADN de CMV a été détecté à des copies par réaction dans des aliquots séparés de PBMC, mais aucun anticorps contre CMV Les bêta-herpèsvirus latents ont été peu fréquemment détectés Dans l’ensemble, des jumeaux, y compris% avec SCF et% sains jumeaux, ont eu EBV dans PBMC Parmi ceux-ci, jumeaux avec CFS et jumeaux en bonne santé ont des résultats positifs définis. D’autres virus ont été détectés dans n’importe quel échantillon. Pour tous les virus détectés chez les jumeaux, nous avons calculé les ORs pour la détection du virus latent chez les jumeaux avec CFS comparés aux jumeaux en bonne santé.

Tableau Détection de l’ADN viral dans des échantillons de cellules mononucléées du sang périphérique provenant de jumeaux monozygotes discordants pour le syndrome de fatigue chronique CFS Nombre de patients, par virus Groupe de sujet, résultat du test viral HHV- HHV- HHV- CMV EBV HSV VZV virus JC BK virus Parvovirus B Jumeaux avec CFS n = Tout positif Positif Faible positif Jumeaux sains n = Tout positif a Positif Faible positif Tous les jumeaux n = Tout positif Positif Faible positif Nbre de patients, par virus Groupe de sujet, résultat du test viral HHV- HHV- HHV- CMV EBV HSV VZV virus JC Virus BK Parvovirus B Jumeaux avec CFS n = Tout positif Positif Faible positif Sain jumeaux n = Tout positif a Positif Faible positif Tous les jumeaux n = Tout positif Positif Faible positif NOTE CMV, cytomegalovirus; EBV, virus d’Epstein-Barr; VHC, virus de l’hépatite C; HHV, herpesvirus humain; Virus de l’herpès simplex du VHS; VZV, varicella zoster virusaLes tests sérologiques étaient négatifs pour IgMView Large

Tableau Évaluation des paires de jumeaux avec virus détectés chez les jumeaux et chez les jumeaux avec syndrome de fatigue chronique SFC versus jumeaux en bonne santé Groupe de sujets, par résultat de test viral et / ou statut CFS HHV- HHV- CMV EBV Parvovirus B Positif pour jumeau avec CFS et négatif pour Comparaison des jumeaux avec CFS vs jumeaux en bonne santé, OR% CI – – ∞ -∞ – – Groupe sujet, par résultat d’analyse virale et / ou statut CFS HHV- HHV- CMV EBV Parvovirus B Positif pour jumeau avec CFS et négatif pour jumeau sain Négatif pour jumeau avec CFS et positif pour jumeau sain Comparaison de jumeau avec CFS vs jumeau sain, OR% CI – – ∞ -∞ – – NOTE Les données ne sont pas% de patients, sauf indication contraire sinon CMV, cytomégalovirus; EBV, virus d’Epstein-Barr; HHV, herpèsvirus humainVue La réplication de l’herpèsvirus LargeLytic n’a pas été détectée Les séquences d’ADN viral de HHV, HHV, CMV ou EBV n’ont été détectées dans aucun spécimen de plasma, mais un jumeau sain a détecté l’ADN HHV dans des échantillons de salive. aux deux antigènes HHV lytiques et latents

Discussion

échantillons de sma étaient négatifs pour HHV-, une constatation compatible avec l’absence ou de très faibles niveaux de HHV-replication lytiqueHHV- a été isolée chez les personnes atteintes de SFC et les personnes en bonne santé Nous avons fréquemment détecté HHV- dans PBMC, comme d’autres investigateurs , mais nous n’avons trouvé aucune association avec CFS Nous n’avons pas détecté d’infection à HHV lytique La découverte que% de jumeaux étaient infectés par HHV- est cohérente avec les résultats de la population américaine [,,] Enfin, l’infection à CMV a également été considérée comme facteurs possibles dans le SCF Deux études ont rapporté que les titres d’anticorps anti-CMV n’étaient pas significativement plus élevés chez les patients atteints de SFC que chez les sujets témoins , mais aucun n’a rapporté de mesures directes de réplication du CMV. Cependant, les jumeaux présentaient un CMV détectable dans les PBMC; Comme les tests sérologiques ont une sensibilité imparfaite et que les résultats de l’ACP plasmatique étaient négatifs, il est peu probable que ce jumeau ait une infection aiguë par le CMV. Plusieurs autres virus ont été recherchés, mais il n’y avait aucune preuve d’infection par les papovavirus. associé à des syndromes neurologiques , ou virus BK associé à une maladie rénale chez des personnes immunodéprimées dans les PBMC Un jumeau présentait une PCR positive pour le parvovirus B, un agent infectieux associé à une anémie chronique Ce sujet n’était pas anémique et ne présentait pas d’IgM des anticorps dirigés contre le parvovirus; Finalement, le pourcentage de jumeaux présentait des anticorps contre le VHC, mais les échantillons de plasma étaient négatifs pour l’ARN du VHC. Cela n’était pas inattendu, car la séroprévalence du VHC aux États-Unis est de ~%, et jusqu’à Les autres micro-organismes impliqués dans le SFC comprennent la Chlamydia et l’entérovirus , mais nous n’avons pas obtenu de spécimens anatomiquement appropriés pour tester la présence de ces agents infectieuxNotre décision d’évaluer les jumeaux mérite d’être commentée La recherche sur les infections virales ou les réponses immunitaires antivirales chez les jumeaux Une étude a rapporté que les titres d’anticorps contre l’EBV, le CMV et le HSV étaient similaires chez les jumeaux [ D’autres études ont observé que les influences génétiques sur le degré auquel un hôte est permissif à l’infection virale et les influences génétiques sur le système immunitaire resp. L’étude des jumeaux monozygotes permet de mieux contrôler les réactions aux virus. Dans notre étude, chaque sujet témoin était identique au patient du même groupe en termes d’âge, de sexe, d’environnement familial et de contexte. De plus, les paires de jumeaux étaient exemptes de médicaments. des échantillons sanguins ont été obtenus en quelques minutes les uns des autres, et les dosages ont été effectués de manière discontinue le même jour. Cette étude a également plusieurs limites notables Premièrement, la méthode utilisée pour identifier l’échantillon de patients n’était pas idéale. Cependant, la stratégie plus désirable d’identifier systématiquement des jumeaux à partir d’un registre double bien défini basé sur la population n’est pas facile à réaliser aux États-Unis. Ainsi, on ne sait pas à quel point les jumeaux sont représentatifs. cette étude portait soit sur des jumeaux en général, soit sur des personnes atteintes du SFC Bien qu’elles aient été choisies sur un point, les jumelles En outre, les caractéristiques démographiques et cliniques de nos jumeaux avec CFS étaient similaires à celles des populations cliniques décrites ailleurs Néanmoins, les profils d’infection virale peuvent différer entre les sous-groupes de patients , comme ceux avec des maladies plus brèves Une deuxième limitation est liée à la taille de l’échantillon Bien que nous ayons trouvé peu de preuves que l’infection virale ait un rôle dans la perpétuation du SFC, certains patients développent la maladie à la suite d’une infection. Troisièmement, comme les jumeaux de notre étude étaient des adultes, principalement des femmes, recrutés dans des cabinets médicaux communautaires et parce qu’ils répondaient à des critères stricts de présence du SFC, il pourrait être impossible de généraliser nos résultats à d’autres échantillons de patients. paramètres cliniques plus spécialisés En résumé, cette étude de co-jumeaux de contrôle des paires de jumeaux monozygotiques discordant f ou SCF n’a pas démontré une contribution majeure à l’infection virale dans la perpétuation du SFC Cette étude n’exclut pas la possibilité que des agents infectieux déclenchent la maladie. Une étude de jumeaux s’ajuste aux caractéristiques héréditaires et à certaines caractéristiques environnementales et convient bien à l’étude des maladies pour lesquelles les groupes de comparaison ne sont pas clairement définis , il s’agit d’un moyen approprié d’examiner la force des facteurs associés au SCF. Les recherches futures devraient examiner le rôle des virus dans certains échantillons de patients, en particulier les patients en début de fatigue.

Remerciements

Nous remercions les participants au registre des jumeaux de l’Université de Washington pour leur coopération, leur patience et leur bonne volonté, et le Dr Leigh Sawyer, chargée de programme, Institut national des allergies et des maladies infectieuses, pour ses encouragements et son soutien. De sages conseils et des encouragements continus, ont amélioré nos efforts scientifiques Enfin, nous remercions le Dr Jack Goldberg pour son examen attentif de l’article en manuscrit et ses nombreuses suggestions utiles tout au long de ce projet