Évaluation sur le terrain des échantillons de sang capillaire en tant que spécimen de prélèvement pour le diagnostic rapide de l’infection par le virus Ebola pendant une urgence épidémique

Contexte Réaction en chaîne par polymérase avec transcription inverse fiable Le diagnostic RT-PCR de l’infection par le virus Ebola requiert actuellement un prélèvement sanguin par ponction intraveineuse. Au cours de l’épidémie actuelle d’Ebola en Guinée, nous avons évalué la facilité d’utilisation des échantillons de sang capillaire. MÉTHODES Un total d’échantillons de sang veineux et capillaire a été prélevé chez des patients admis au Centre de traitement Ebola à Guéckédou, en Guinée, entre juillet et août. Tous les échantillons ont été analysés par RT-PCR en utilisant le RealStar. Nous avons comparé des échantillons obtenus par ponction veineuse et ceux obtenus par prélèvement sanguin capillaire absorbé sur des dispositifs d’écouvillonnage. Résultats La sensibilité et la spécificité des tests effectués avec des échantillons de sang capillaire étaient%% intervalle de confiance [IC],% – %; / patients et%% IC,% -%; / patients, respectivementConclusions Nos données suggèrent que les échantillons de sang capillaire pourraient servir d’alternative aux échantillons de sang veineux pour le diagnostic de MVE dans les milieux à ressources limitées en situation de crise. Cela peut être particulièrement utile dans les cas où la ponction veineuse est difficile. , avec les nouveau-nés et les nourrissons ou lorsque les patients adultes rejettent la ponction veineuse pour des raisons culturelles ou religieuses

L’épidémie actuelle d’Ebola en Afrique de l’Ouest a été décrite pour la première fois en mars en Guinée Depuis lors, le virus Ebola s’est largement répandu dans les pays voisins du Libéria et de la Sierra Leone. l’épidémie actuelle d’Ebola s’est limitée à ces pays, des cas ont également été signalés au Mali, au Nigéria et au Sénégal ainsi qu’en Europe et aux États-Unis En mars, l’OMS a signalé un total de cas d’Ebola La maladie à virus Ebola avec décès , faisant de la flambée épidémique en Afrique de l’Ouest l’épidémie d’Ebola la plus répandue et la plus complexe géographiquement depuis la découverte du virus Ebola en Les taux de létalité déclarés varient de% à Les pays africains Les mesures efficaces de confinement des flambées incluent l’isolement strict des patients atteints de MVE, ce qui nécessite un diagnostic fiable Méthodes actuelles de diagnostic su infection par le virus Ebola: transcription inverse, amplification en chaîne par polymérase RT-PCR, ELISA immuno-enzymatique avec capture d’antigène et immunoglobuline M IgM et immunoglobuline G IgG ELISA Bien que la détection de l’ARN viral ou de l’antigène viral soit efficace des infections par le virus Ebola du début à la fin de la maladie, la détection sérologique des anticorps IgM et IgG spécifiques ne peut être utilisée que pour diagnostiquer la MVE au dernier stade de la phase aiguë de la maladie et pendant la convalescenceToutes les techniques actuelles pour un diagnostic fiable En outre, l’utilisation de prélèvements de liquides buccaux a été suggérée comme méthode non invasive et sensible pour la détection des infections par le virus Ebola lors d’investigations épidémiologiques L’échantillonnage sanguin veineux nécessite une formation et le personnel médical qualifié, porte un risque élevé de blessures par piqûre d’aiguille, et est particulièrement diff En outre, les patients en Afrique refusent souvent la ponction veineuse en raison de croyances culturelles et religieuses. Pour surmonter ces problèmes, nous avons évalué l’adéquation des prélèvements sanguins capillaires au bout des doigts dans le diagnostic de MVE. L’objectif principal de cette étude était de comparer la sensibilité et la spécificité des tests qui ont utilisé des échantillons de sang capillaire avec des échantillons obtenus par ponction veineuse lors d’une urgence épidémique En outre, nous avons évalué dans une étude limitée la stabilité des échantillons de sang capillaire conservés à température ambiante vs ° C

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Approbation éthique

Le Comité national d’éthique de la recherche médicale de Guinée a approuvé l’utilisation d’échantillons de restes diagnostiques pour ce numéro de permis d’étude / CNERS / Comme les échantillons avaient été collectés dans le cadre de la réponse de santé publique pour contenir l’épidémie en Guinée, des patients

Collecte d’échantillons

L’étude a porté sur des patients présentant des symptômes compatibles avec la définition de cas de MVE de l’OMS Des échantillons cliniques ont été prélevés par le personnel médical de Médecins sans Frontières MSF au Centre de traitement Ebola. Pour chaque patient, du sang total prélevé par ponction veineuse et des échantillons de sang capillaire prélevés au bout des doigts ont été prélevés en même temps. Des échantillons de sang total prélevés sur des veinopuncture ont été prélevés en utilisant des tubes de prélèvement BD Vacutainer contenant de l’acide éthylènediaminetétraacétique. EDTA Becton Dickinson, East Rutherford, New Jersey Des échantillons de sang total capillaire ont été prélevés à l’aide de lancettes activées par contact BD Microtainer, type B Becton Dickinson, East Rutherford, New Jersey Le sang capillaire collecté a été adsorbé sur des applicateurs de prélèvement de viscose Sarstedt, Allemagne Immédiatement placé dans un tube de prélèvement stérile étiqueté sans milieu de transport viral. Les échantillons ont été stockés à température ambiante. La température moyenne à Guéckédou est de ° C en juillet et août jusqu’à leur transfert au laboratoire pour analyse. Recommandations de sécurité de l’OMS pour l’expédition des échantillons Tous les tubes, contenants en plastique et sacs en plastique scellés utilisés pour le transport ont été désinfectés en surface avec une solution d’hypochlorite% et transportés au Laboratoire mobile européen de Guéckédou où ils sont arrivés en moyenne une heure après leur prélèvement. échantillon de sang et échantillon d’échantillon de doigts du même patient ont été étiquetés avec le même numéro d’identification de laboratoire unique et une marque supplémentaire pour les échantillons de sang capillaire Tous les échantillons ont été soumis aux mêmes conditions de manipulation et de stockage 120 échantillons de sang veineux et capillaire suspect d EVD ont été obtenus

Tests de laboratoire

Des échantillons d’échantillons infectieux ont été manipulés au laboratoire mobile européen de Guéckédou, en Guinée, par un personnel de laboratoire qualifié et qualifié utilisant une boîte à gants de sécurité mobile équipée de filtres P et ABC et fonctionnant avec une pression négative. détection de l’ARN du virus Ebola par RT-PCR en utilisant RealStar Filovirus Screen RT-PCR Kit altona Diagnostics, Allemagne , ciblant spécifiquement le gène L comme décrit précédemment Des contrôles négatifs et positifs ont été inclus dans chaque lot d’échantillons analysés. des résultats de RT-PCR en temps réel spécifiques au virus Ebola en indiquant une inhibition potentielle de la RT-PCR, un contrôle interne a été analysé en parallèle pour chaque échantillon de patient RT-PCR en utilisant la technologie SmartCycler Céphéide A cette fin, des aliquotes μL de chaque échantillon ont été inactivés en ajoutant μL du tampon de lyse au thiocyanate de guanidine AVL Après quelques minutes d’incubation, μL d’absolut Tous les tubes d’échantillon ont été désinfectés en surface en utilisant un% de solution d’hypochlorite pendant quelques minutes avant d’être libérés de la boîte à gants. Pour l’analyse RT-PCR des échantillons sanguins de ponction veineuse, μL de sang total EDTA plus μL d’eau sans nucléase; Qiagen, Allemagne ou plasma μL a été utilisé pour l’extraction d’ARN en utilisant le kit QIAmp Viral RNA Qiagen, AllemagnePlasma a été obtenu par centrifugation de sang total EDTA à tpm pendant minutes Comparaison des charges virales Ebola par RT-PCR en μL de sang total EDTA ou μL ont révélé des résultats similaires données de terrain non publiées Des écouvillons ont été tourbillonnés dans μL d’eau sans nucléase Qiagen, Allemagne dans un tube -mL Eppendorf pour redissoudre le matériel biologique, et μL de surnageant a été utilisé pour l’extraction d’ARN avec le kit QIAmp Viral RNA Extraction et purification d’ARN Pour le diagnostic différentiel, les patients admis dans l’ETC ont été testés pour des infections palustres à l’aide de sang total EDTA veineux pour la détection qualitative des antigènes de l’espèce Plasmodium dans le sang. un test immunochromatographique in vitro disponible dans le commerce utilisant BinaxNOW Malaria Alere

Analyses statistiques

Pour déterminer la sensibilité et la spécificité des tests d’échantillons de sang capillaire, les résultats de RT-PCR ont été comparés à ceux obtenus avec des échantillons de sang veineux. La sensibilité et la spécificité des tests ont été calculées en utilisant un tableau de contingence.

RÉSULTATS

Lors de l’épidémie d’Ebola en Guinée, les patients guinéens présentant des symptômes cliniques de MVE ont été inclus dans l’étude. Parmi les patients,% étaient des hommes et% étaient des femmes L’âge moyen était de plusieurs années. patient et analysé pour la présence d’ARN du virus Ebola par RT-PCR en temps réel des échantillons de sang capillaire analysés, testés positifs et négatifs pour EVD Pour les échantillons de sang veineux correspondants, testés positifs et négatifs pour EVD Résultats identiques entre échantillons capillaires et veineux Pour les échantillons de sang capillaire avec des résultats identiques, testés EVD positifs et testés EVD négatifs Dans notre étude, aucun résultat faux positif n’a été observé en utilisant des échantillons de sang capillaire comme diagnostic. spécimen La sensibilité et la spécificité des tests réalisés avec des échantillons de sang capillaire absorbés o les dispositifs sur écouvillon comparés aux tests effectués avec des échantillons de sang veineux étaient%% intervalle de confiance [IC],% -%; / patients et%% IC,% -%; / patients, respectivement Tableau Tableau résume l’analyse comparative de la détection EVD par RT-PCR dans les échantillons de sang veineux et de sang capillaire en fonction du temps d’échantillonnage après l’apparition des symptômes cliniques A l’exception de la paire d’échantillons, comparaison par paires veineuse et capillaire correspondante. des échantillons de sang ont révélé des taux plus bas d’ARN Ebola dans les échantillons de sang capillaire, indépendamment du moment de l’échantillonnage après l’apparition des symptômes. Des résultats RT-PCR faussement négatifs provoqués par l’inhibition de la RT-PCR ont été rapportés chez des patients atteints de fièvres hémorragiques virales. Les valeurs de Ct du contrôle interne correspondant à chaque échantillon de patient ont indiqué qu’une valeur de Ct plus élevée ou même un résultat de RT-PCR négatif pour l’ARN spécifique au virus Ebola dans les échantillons de sang capillaire n’était pas dû à une inhibition sévère de la RT-PCR. , Figure supplémentaire

Sensibilité de table et spécificité des tests effectués sur des échantillons de sang capillaire pour le diagnostic de l’infection par le virus Ebola Détection du virus Ebola avec des échantillons de sang capillaire Détection du virus Ebola avec des échantillons veineux veineux positifs Total négatif positif positif Détection du virus Ebola avec des échantillons de sang capillaire Les résultats de la détection du virus Ebola dans les échantillons capillaires capillaires ont été comparés aux échantillons obtenus par ponction veineuse en utilisant la réaction en chaîne de la polymérase par transcription inverse en temps réel. La sensibilité pour la détection du virus Ebola les échantillons de sang capillaire étaient%% intervalle de confiance [IC],% -%, la spécificité était%% CI,% -%, et le rapport de vraisemblance négatif était% CI, -View Large

Positif Positif Jour Positif Positif – Jour du Patient Positif Positif Jour du Patient Positif Positif Jour du Patient Positif Positif Jour du Patient Positif Positif Jour du Patient Positif Positif Positif Jour du Patient Positif Positif Positif Jour du Patient Positif Positif Négatif – – NA Jour du Patient Positif Négatif – – NA Jour du patient Positif Jour du patient positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Positif Positif Positif Jour Positif Positif Positif Positif Positif Positif Positif Négatif – – NA Jour Patient Positif Positif Patient Positif Positif Patient Inconnu Positif Négatif – – Sans Nbre d’échantillon testé Patient Non Jour d’échantillonnage après Symptôme Début de la détection EVD dans la valeur du CT veineux Charge virale semi-quantitative Resulta Détection EVD dans la valeur du CT du sang capillaire Différence entre les échantillons de sang veineux et capillaire C Différence entre échantillons sanguins veineux et capillaires Jour du patient Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour Positif Positif pour le Patient Positif Positif Positif pour le Jour Positif du Patient Négatif – – NA Jour du patient Positif Jour du patient positif Jour du patient positif Positif – Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Négatif – – NA Jour du patient Positif Négatif – – NA Jour du patient Positif Jour du patient positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Positif Positif Positi Positi ve Jour du patient Positif Jour du patient positif Positif Jour du patient positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Jour du patient Positif Positif Positif Négatif – – NA Jour du patient Positif Positif Patient Jour Positif Patient Positif Inconnu Positif Négatif – – NA Abréviations: Ct, seuil de cycle; MVE, maladie à virus Ebola; NA, non applicable Les valeurs de Ct sont classées dans les catégories suivantes – hautement positives, – positives et – faiblement positives et correspondent à, et résultats, respectivementb. Le résultat négatif de la réaction en chaîne de la polymérase en temps inverse est indiqué par « – » c Les différences Ct indiquent une charge virale plus élevée dans l’échantillon de sang veineux, tandis que la charge virale est plus élevée dans l’échantillon de sang capillaire. La différence dans les valeurs Ct peut provenir des différences d’efficacité de l’ARN viral entre les deux types d’échantillons. Le prélèvement séquentiel d’un patient individuel nous a permis de surveiller les niveaux de charge virale Ebola dans les échantillons de sang veineux et capillaire au cours de la maladie clinique, en particulier dans la phase précoce des patients symptomatiques. Tableau Ce patient, soupçonné d’avoir EVD sur la base de symptômes cliniques, a été admis Le test de RT-PCR a été répété quelques heures plus tard et le patient a été testé positif à l’ARN Ebola dans l’échantillon de sang veineux, mais est resté dans l’ARN Ebola. négatif dans l’échantillon de sang capillaire Le jour, les deux types d’échantillons ont eu un EVD positif, l’échantillon sanguin veineux montrant une charge virale plus élevée que l’échantillon de sang capillaire. Le jour, les résultats EVD positifs ont révélé des valeurs Ct similaires pour le sang capillaire et veineux , indiquant une charge virale comparable Ces données indiquent des différences potentielles de virémie entre le sang veineux et capillaire en fonction du moment de l’apparition de la maladie Ceci pourrait également expliquer les résultats discordants supplémentaires entre sang veineux et sang capillaire du jour et du jour après l’apparition des symptômes. avec de faibles nombres de patients, d’autres études sont nécessaires pour comparer la cinétique de la charge virale dans le sang veineux et capillaire. od au cours de l’infection

Tableau Résultats de la réaction en chaîne de la polymérase en temps réel d’un patient lors d’une étude de suivi pendant son séjour au centre de traitement Ebola, Guéckédou, Guinée, août Journée d’échantillonnage après le début du symptôme EVD dans la valeur du volume sanguin veineux Charge Virale Semiquantitative Resulta EVD Détection de la Valeur du Ct du Sang Capillaire Charge virale semi-quantitative Résultat Jour Négatif – – Négatif – – Jour Positif Négatif – – Jour Positif Positif Positif Jour Positif Positif Jour d’échantillonnage après le début de la détection EVD dans le sang veineux Valeur virale EVD Detection in Capillary Blood Ct Valeur Charge virale semi-quantitative Résultat Jour Négatif – – Négatif – – Jour Positif Négatif – – Jour Positif Positif Jour Positif Abréviations positives: Ct, cycle threshold; EVD, Ebola Virus Diseasea Les valeurs Ct sont classées dans les catégories suivantes – très positives, – positives et – faiblement positives et correspondent à, et résultats, respectivement Résultat négatif de la réaction en chaîne par polymérase en temps réel négatif est indiqué par « – » Voir Large Pour le diagnostic différentiel des patients nouvellement admis ont été testés pour les infections paludiques Espèces Plasmodium utilisant un test de diagnostic rapide basé sur l’antigène Parmi les patients testés positifs pour la MVE, les patients ont obtenu un résultat positif et négatif pour le paludisme. Comparaison des résultats entre des échantillons de sang capillaire et veineux appariés et des coïncidences paludéennes montrant que les coinfections paludiques n’ont pas d’influence sur la détection sensible et spécifique de la MVE lors de l’utilisation d’échantillons de sang capillaire. à Guéckédou avec le Mobi européen Les échantillons de sang prélevés sur les patients, y compris les échantillons de sang capillaire, pourraient être traités en quelques heures pour un diagnostic en laboratoire. Cependant, dans d’autres contextes, le délai entre la collecte des échantillons et l’analyse en laboratoire pourrait être beaucoup plus important. Dans les cas où le diagnostic EVD ne peut être effectué dans les heures qui suivent le prélèvement, l’OMS recommande une température de conservation entre ° C et ° C pour les échantillons afin de préserver la conservation des échantillons . dégradation rapide de l’échantillon lorsque des échantillons d’écouvillon de sang capillaire ont été stockés pour & gt; heures à température ambiante par rapport aux échantillons correspondants stockés à ° C, indiquant un impact des conditions de stockage sur la détection d’acide nucléique Ebola sensible par RT-PCR en utilisant des échantillons de frottis de sang capillaire données non montrées

DISCUSSION

En raison de la spécificité% observée des résultats des tests dans notre étude de terrain, nous considérons un résultat de laboratoire EVD positif à partir d’échantillons de sang capillaire valide pour une évaluation diagnostique fiable L’échantillonnage sanguin capillaire peut donc représenter une approche diagnostique appropriée Pour un dépistage rapide initial d’un grand nombre de patients en cas d’épidémie, permettant une prise en charge accélérée des patients et des mesures d’isolement. Les cas suspects de MVE avec des échantillons de sang capillaire doivent être testés en utilisant des échantillons de sang veineux. Diagnostic EVD par RT-PCR De même, à l’heure actuelle, le sang veineux est recommandé pour tester les patients pendant la phase de convalescence afin d’améliorer leur prise de décision et leur réintroduction dans la communauté. des échantillons de sang veineux peuvent être Jusqu’à présent, aucune information n’est disponible sur la cinétique de la charge virale Ebola dans le sang capillaire au cours de l’infection. Les études futures devraient traiter de la virémie dans le sang capillaire en fonction du stade clinique de la maladie. Figure supplémentaire Bien que l’introduction de volumes sanguins identiques, par exemple de vacutainers de sang total dans la préparation des échantillons, soit facile à réaliser, l’adsorption et la désorption du sang capillaire des doigts peuvent Les études ultérieures devraient aborder la standardisation des procédures de collecte et des volumes d’échantillonnage pour l’approche par écouvillonnage. Enfin, nous avons comparé le sang anticoagulé EDTA collecté par des échantillons de sang veineux et capillaire déposés sur des dispositifs en écouvillon en viscose. , démontrant aucune activité anticoagulante Des effets protecteurs de l’EDTA sur la stabilité de l’ARN pathogène dans les échantillons de sang ont été rapportés Malgré cela, nous avons choisi ces dispositifs pour notre étude de comparaison, comme les unités mobiles européennes de Guéckédou, Guinée, et Foya, Liberia, ont reçu un nombre considérable d’échantillons de sang capillaire absorbés sur des écouvillons en viscose comme échantillon de diagnostic chez des nourrissons et des adultes pour EVD test non publié Bien que ces types d’écouvillons sont couramment utilisés pour la détection sensible du virus Ebola dans les fluides oraux. l’épidémie actuelle de MVE en Afrique de l’Ouest, la connaissance de la stabilité de l’ARN du virus Ebola ou des effets potentiels de dégradation dans les échantillons de sang capillaire absorbés sur des écouvillons peut être faible. négatif Ainsi, la valeur des écouvillons comme un dispositif de collecte et de stockage pour les échantillons de sang capillaire pour diagno Les prélèvements sanguins capillaires offrent certains avantages par rapport à l’échantillonnage sanguin par ponction veineuse. L’échantillonnage peut être effectué par du personnel médical autre que des phlébotomistes expérimentés et formés. Pour des raisons de commodité et dans certaines circonstances pour des raisons culturelles et des croyances religieuses, cette procédure peut être plus acceptable que le prélèvement sanguin veineux. Ainsi, la collecte moins invasive d’échantillons élimine l’anxiété associée à la ponction veineuse. Par ailleurs, la collecte de sang par capillarité est la méthode préférée pour la collecte de spécimens sanguins chez les nouveau-nés et les nourrissons. Ces raisons pratiques peuvent contrebalancer la sensibilité plus élevée observée dans certains cas pour l’analyse du sang veineux. La détection fiable et la confirmation en laboratoire du virus Ebola sont essentielles pour maîtriser l’épidémie actuelle de MVE en Afrique de l’Ouest L’OMS a identifié un besoin permanent de développer des tests sensibles et spécifiques pour le diagnostic de la maladie à virus Ebola en utilisant un point de contact accessible. Notre rapport est la première étude qui compare la sensibilité des tests EVD basés sur la RT-PCR sur des échantillons de sang capillaire vs veineux. l’évaluation des échantillons de sang capillaire dans les conditions de terrain est toujours nécessaire, nos résultats pointent vers l’utilisation d’échantillons de sang capillaire comme un spécimen de prélèvement approprié pour le diagnostic sensible et spécifique de la MVE. En conclusion, cette étude démontre la valeur du sang capillaire spécimen pour le diagnostic virologique de l’infection par le virus Ebola au cours d’une épidémie rgency

Remarques

Remerciements Nous remercions tous nos collègues du projet European Mobile Laboratory pour leur engagement lors de l’épidémie actuelle de virus Ebola en Afrique de l’Ouest. Nous remercions les équipes de terrain de Médecins sans Frontières et de l’Organisation Mondiale de la Santé et les autorités sanitaires locales de Guéckédou pour leur excellente coopération. Les travaux ont été menés dans le cadre du projet EVIDENT Virus Ebola: Corrélats de protection, déterminants des résultats et gestion clinique, financé par l’accord de subvention Horizon pour la recherche et l’innovation de l’Union européenne et dans le cadre du contrat de service IFS / / – financé par la Direction générale de la coopération internationale et du développement Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit d’intérêt potentielTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits potentiels de conflits d’intérêts que les éditeurs considèrent comme pertinents pour le contenu du manuscrit. été divulgué